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如何實現光學超分辨(下)
如何實現光學超分辨(下)
中科院物理所     阅读简体中文版

席鵬著


第六章 PALM/fPALM 你掌心的痣我總記得在哪里



其實自從上次寫完STORM,對于采用“開關-定位”這一族超分辨技術來說,已經沒有什么更新鮮的技術可寫了。但是這里有兩個幾乎在同一時間被發明的孿生兄弟,卻不得不提。先把兩篇文章的信息放上:

  • Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess, “Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution”, Science 2006 Vol. 313 no. 5793 pp. 1642-1645  (Received for publication 13 March 2006. Accepted for publication 2 August 2006. Published Online August 10 2006)


  • Samuel T. Hess, T. P. K. Girirajan, and M. D. Mason, “Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy,” Biophysical Journal, vol. 91, no. 11, pp. 4258-4272, 2006. Submitted June 12, 2006, and accepted for publication August 28, 2006. Published 1 December 2006

很多事件都非常相似,但是沒有這么相似:這兩個技術,第一個叫PALM,第二個叫FPALM;發明人中,第二個發明人叫Hess,第一個的發明人之一、共同第一作者也叫Hess(如果把s掰直成l,那就是STED的發明人教主Hell,更亂了);第一個投出時間在06年3月早春,第二個是在06年夏天6月。





Eric Betzig


Harald Hess


Samuel Hess


先說Eric Betzig,我是很有幸讀到他的那篇2006年的Science論文,發現他竟然和我同在美國密西根州蘭欣市。然后在組會上給大家介紹他的工作,我老板也很驚訝:“哦,是他啊?原來做近場光學的,早幾年我們還一起吃過飯、討論過關于光學成像的相關問題。后來他自己出去開公司了,就沒了聯系。沒想到他竟然去了HHMI。”

于是我就很得意地暢想,或許,我們曾經在同一條河里釣過bash,只不過不在同一個時空而已。甚至,有可能從他鉤下逃脫的小魚,剛好在另一個時域被我撈起。蘭欣能釣魚的地方并不多。

Eric Betzig,一個典型的高帥富的奮斗故事。以下故事部分來源于HHMI的個人介紹,和2008年Nature Photonics的編輯采訪:

Eric本科畢業于Caltech,在康奈爾大學獲得博士學位。之后進入貝爾實驗室,在那里的六年中,他研究近場光學(上篇帖子里有讀者希望我再寫一點perfect lens的超分辨,其中就有很多是近場光學倏逝波的探測)并將其用于生物細胞成像。他注冊了一家公司叫New Millennium Research,但是很快就得到父親的召喚,去管理他們的加工業帝國。要知道,在汽車工業興盛的密西根州,加工業的地位舉足輕重。

在那里,有一個困擾著加工業多年的問題,也許因為它太難,所以大家對它習以為常,熟視無睹:為了加工一個小部件,必須讓一個很大很重的部件移動或停止。這樣,很多的時間和能量消耗在了移動加工工具上。Eric巧妙地讓加工機械高速移動,卻不犧牲加工精度。因此極大地提升了加工效率。

但是,燕雀安知鴻皓之志。在無數個深夜,Eric在夢里都回到了他熟悉的顯微鏡前,那里,一個個細胞在游動,神秘的生命信號在傳遞。然而,模糊的雙眼無法看清這一切。。。他驚醒了!因為他想到了應該怎么做就能看到這一切的神奇。

然而Eric也是一個十分現實的人:在申請職位的時候,他的簡歷上,有十年之久是學術空白。“要想讓這個世界再聽你的理論,你必須拿出一些讓人折服的好東西。”Eric說。

可是,他老爹似乎并不是非常支持兒子離開家族企業。Eric在到HHMI之前,沒有自己的實驗室。其實要想留住兒子,劃出30平米的小房子做個實驗室,應該不是難事。

Eric他們所有的實驗都因陋就簡,大部分是在他的好朋友,Harold Hess在加州的的公寓改裝的實驗室完成的。在那里,他們把光學平臺放在客廳里,鼓搗他們的新型顯微系統。可能我們讀者里面,很多人的實驗室硬件條件比他們更好。

Hess承認,自己與Betzig對生物學的認識都不深。但是他們堅信,生物學的發展能夠為超分辨帶來轉機。于是,他們屢敗屢戰了15年,希望能運用生物學知識獲取高分辨率的顯微圖像。當Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年發明的光敏綠色熒光蛋白(photoactivatable green fluorescent protein)后,他們知道他們已經找到了解決問題的關鍵所在:開關-定位。

接下來的整個冬天,Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那間狹小的沒有取暖設備的實驗室里工作。

三個人,一個團隊。沒有漫長的圣誕假期,沒有奢侈的實驗裝備,有的,只是一個共同的信念支持著他們前行:既然理論上可行,那就不要借口。我們一定要在實驗上證明它!

冬去春來的時節,他們終于看到了轉機。回想起當時的情形,Lippincott-Schwartz指出:“他們當時非常激動。我還記得當我們得到第一張顯微圖像時,你根本無法看出那是什么東西。直到我看到他們將熒光圖像和電鏡圖像疊加之后的結果才相信,我們成功了。我當時覺得這一切真是太神奇了。”

2006年,Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小組在《科學》雜志上發表了他們的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到細胞黏著斑和特定細胞器內的蛋白質。整個出版過程:3月13號投稿,8月2號接收,10號網上發表。




PALM用于觀察溶酶體跨膜蛋白。


再來說說FPALM的故事。Samuel T Hess,分別在耶魯大學和康奈爾大學完成本科和博士學位;當時在Maine大學担任助理教授。在那兒他申請了一個課題,很快要結題了,所以有些經費要趕緊花掉(美帝也有類似制度)。但是Samuel并沒有隨便買些家當,而是沉迷于和學校的化學工程師和生物學工程師的一些討論:如何提高觀察活體細胞脂筏結構的分辨率?

2005年的一個夏夜,Hess被一陣電子打擊樂吵醒。鄰居家又在舉辦舞會了。無奈啊,愛好宴樂的蕓蕓眾生,哪知道我等科研工作者都是不眠不休的怪物呢?半睡半醒的Hess走下樓來,本想出去告訴他們安靜些,但是礙于情面(看過《生活大爆炸》的讀者大概都知道,我們科學家是多么不擅長這個的),只好作罷。他隨手畫了一副設計圖,可以通過借助熒光標記的蛋白質來顯示細胞形態。

所以,我經常教育我的學生:當你思路不清楚的時候,畫圖!

第二天早上,當Hess重新翻看這幅非清醒狀態繪制的潦草的設計圖時,不由得大笑起來:它是那么簡潔,但解決了“看不清”的難題。不可能吧?再看看,令人吃驚的是,這幅設計圖竟然沒有未被任何物理原理。于是他將信將疑地把這幅圖拿給物理系的同事peer review,也沒有發現任何問題。

接下來,Hess就按照他的設計圖開始制作顯微鏡了。此時,他的科研經費所剩不多,而結題時間轉眼就到。因此,Hess等人以最快的速度組裝好顯微鏡,并進行了試驗。同時,在不到兩天的時間里,緬因州立大學表面科學技術實驗室的同事就為Hess制備好供檢驗顯微鏡效果的藍寶石晶體樣品。所以,有一個高效的合作團隊至關重要。

相比與Eric等人的效率,Samuel還是相對有點慢了:從2005年有了想法、做了實驗到2006年6月文章投出,他用了一年時間。這個幾乎直接導致了他的工作的影響因子比Eric他們差了一個數量級。同時,由于他作圖相對潦草——未能在生物細胞上演示這一工具的強大魅力,也直接導致了他的工作相對不大受到關注。

2006年底,《生物物理學期刊》(Biophysical Journal)刊登了Hess小組的科研成果。2007年,Hess小組證明了FPALM可以分辨細胞膜脂筏上的蛋白質簇。


回到我們本章的標題。PALM/FPALM,突然想起了林憶蓮的《至少還有你》:

如果   全世界我也可以忘記

至少還有你

值得我去珍惜

你掌心的痣

我總記得   在哪里。


在《圣經—新約》里,耶穌第二次來到門徒中間,門徒們認不出已經變了身的救主。于是耶穌將手讓門徒看。當門徒們看到那釘痕,立刻就分辨了出來,就歡呼:“是主!”從此,幾個沒有受過教育的村夫,幾個已經嚇破膽準備散伙的門徒,重新團結起來,將耶穌的思想傳遍了世界,影響著我們今天的主要生活。

PALM,也正是因為在手掌(衍射極限分辨決定的區域內)范圍內通過蛋白質開-關的效應,因為只有一個釘痕,所以就能夠通過定位將其分辨出來了。




在寫完本章的同時,很欣喜地知道,我們的超分辨文章發表在PLoS ONE上。看來科普有好報啊!這一工作是我國首次實驗報道STED超分辨,且在三種細胞器和RNA上均驗證了STED所帶來的分辨率提升。

由于PLoS玩的是paper2.0,也就是論文的影響不再是SCI因子說了算,而是讀者您說了算,期待大家注冊個賬號并給點掌聲!我們在那里互動一下吧!你的支持是我繼續寫下去的動力!

文章鏈接:

我國STED超分辨工作在PLoS ONE發表
科學網報道:研究實現STED超分辨率光學顯微成像


第七章    SSIM 疏影橫斜水清淺


2011年的FOM閉幕式上,會議主席Fred Brakenhoff很遺憾地通知大家,Mats Gustafsson教授不幸因癌癥逝世,享年51歲。
       2012年的FOM的副主題,就是紀念這個偉人和他帶給這個世界的SSIM。

什么是SSIM?全名Saturated Structured Illumination Microscopy,飽和結構光照明顯微。在介紹SIM之前,可以給大家看一張非常典型的照片:


在椅子背上,你看到了什么?不規則的條紋,對不對?這種條紋,如果你把圖片放大,可以看到是由于椅子前后的網狀織物疊加而成。在科學上,大家將其稱為莫爾條紋。


由于織物的網格比較密不容易被看到(頻率高),莫爾條紋則比較粗容易被看到(頻率低),因此如果知道B的結構,和A+B所疊加的莫爾條紋,將不能探測的高頻轉化為能探測的低頻,就能夠反推出A所攜帶的精細結構信息。這就是SIM的精義。如下圖所示。


回顧另一種能夠帶來分辨率提升的、廣為人知的技術:共聚焦。共聚焦通過一個點照明,加一個針孔實現分辨率提升。準確地說,由于在分辨率這個事情上,鄰居總是給我們干擾,所以用一個針孔把鄰居的光噪聲給它擋上,就能夠將分辨率提升。

共聚焦通過阻擋接收實現分辨率提升,而SIM則是通過給照明光一個調制實現分辨率提升。

能提升多少?共聚焦是1.4倍,因為即使針孔小到只有一個點,根據光路可逆原理,這個點到了樣品上也有點擴展函數那么大,最終,共聚焦的點擴展函數就是激發光的點擴展乘以針孔點擴展。如果將SIM的結構調制通過共軛放在接收端,則SIM也是一個一維調制。進一步,通過從多個角度進行一維限制,可以最終得到二維的分辨率提升。目前,比較流行的是每隔120度進行一次。SIM可以提升2倍的分辨率。

如果想進一步提升分辨率,則需要更細的線條。而前面我們講過,用光學一次成像,所能得到的細線的粗細是受衍射極限限制的。解決的方案只有一個,那就是通過某一類的飽和機制,形成更細的線。這樣,再加上SIM提升的2倍,就能夠實現完全突破衍射極限的限制了。
   發張SIM的圖片,給大家驚艷一下。

A wide-field microscopy image (left) and a superresolution structured illumination microscopy (SR-SIM) image (right) each shows actin (green) and tubulin (red) cytoskeleton in a primary chicken fibroblast. (http://www.photonics.com/Article.aspx?AID=47750)


寫到這里,我想很多人都會對超分辨顯微這一領域躍躍欲試了。但是,你可能會覺得,自己沒有相關的科研背景。有意思的是,Mats Gustafsson在他開始博士后研究時,并沒有正規的光學訓練。他之前是從事電子學的。他在接受采訪時說:“我的電學背景讓我對這個世界有一種獨到的認識----我看問題喜歡從頻域而不是空域。這是我成功的主要原因。”因此,如果你想從事一個你喜歡的行業,你的背景絕對不是問題。相反,不能下定決心、有了志向卻不努力,才是影響你成功的主因。

Mats在2005年就被診斷患有癌癥。但是他天性樂觀,對人友善,對科學卻有一種執著的追求。2009年在波蘭的FOM會議上,Mats做完plenary presentation后,(那個時侯他已經在這個領域赫赫有名了),有一個女士在路上向他問問題。他蹲在路邊從行李中拿出一個筆記本,認真地在上面畫示意圖進行解釋。

有一次一個科學編輯問他,是什么力量讓他如此癡醉于科研?他說:“想像一下,你所處的世界是一個填字游戲。你站在這個游戲中間。你會開始用想象力去填它,還是會熟視無睹?”他停了一下,又說,“我無法想象讓自己停下來不去填。這就是我為什么做科研的原因。”


Mats Gustafsson(1960-2011)。后面的籬笆是否讓你聯想到了SIM?



讓我們紀念Mats,不僅因為他在科研上給我們帶來了全新的方法造福人類,而且因為他的謙遜與執著,將照亮我們前行的路。




席鵬課題組文章鏈接:

我國STED超分辨工作在PLoS ONE發表

OE: 利用共聚焦實現DIC位相浮雕


第八章 大結局:陰陽定乾坤


經過前面八章的描述,我想讀者已經對超分辨的各種方法有了一定的認識。各種方法和他們的名字,如同八仙過海一般,一個個涌現在我們眼前。

正如牛頓用三定律描述世界,愛因斯坦用相對論描述時空一般,去繁就簡,才是大道。

那么,可不可以將這些超分辨技術統一為一種描述?

答案是可以,那就是:陰陽。



《易傳·系辭上傳》說:“是故,易有太極,是生兩儀”。太極即為天地未開、混沌未分的狀態。也就是說,所謂的混沌,就是一種不能區分的狀態。為了有效地進行區分,才有了陰陽兩儀。結合現代技術,陰陽,就是兩種狀態,也就是我們熟悉的二進制的ON(開)和OFF(關)狀態。

反過來看看我們的超分辨技術。STED,通過區分一個點的自發輻射(on)和受激輻射(off)實現超分辨;SSIM,通過調制一系列平行的ON-OFF實現超分辨;PALM/STORM則是隨機地調制點的ON-OFF實現超分辨。

再來細看的話,STED和SSIM均是形成一個結構性的光調制來實現超分辨,不依賴于特定的熒光染料。而PALM/STORM則是通過特定染料的性質,通過光控制來實現ON-OFF。

這兩類各有優劣:STED需要依賴共聚焦系統,并在其上加一個環形受激輻射光,光路最為復雜,所需要的光功率也非常高,但不需要進行復雜的圖像后期處理;SIM則相對來說儀器比較簡單(從三個方向上探測莫爾條紋即可),所需功率也較低,但是如果進行SSIM(飽和成像)的話,則功率要求一樣很高,且需要進行圖像后期頻域處理;PALM/STORM則只需要將一個TIRF系統的入射光變為兩束,相對的實驗門檻低,且所需功率較小(受不同熒光蛋白的開關特性約束);然而后期圖像處理需要逐點進行定位。

也許有人會說,這個領域既然已經如此成功,而且已經總結得如此透徹,是不是沒什么新東西可做了?

絕非如此!今年的七月Nature Methods又一次開始重點關注顯微領域,包括新的超分辨技術,以及傳統顯微與生物信息學的結合。

親愛的讀者,感謝你陪伴著我寫完了這個blog系列。你們的評語和點擊,是我在繁忙的工作之余拼命擠出時間筆耕的源動力。

祝愿超分辨技術不斷演進,成為生命科學認識世界的全新工具。Seeing is believing.

愿大家看了這一系列博文,能夠有所收獲,在將來的科研中,如果是應用,那么不論是應用商用的還是搭建的超分辨系統時,能夠有更加透徹的理解;如果是建立新的系統,那么希望這些博文成為你創新的一個啟迪。

牛頓說,我之所以看的遠,是因為我站在巨人的肩膀上。Google Scholar的motto便出于此。希望這一系列博文,成為你通向巨人肩膀的一個梯子!

(全文完)

(來源:席鵬科學網博客)


2015-08-23 08:44

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